蚯蚓凍干機(jī)的纖溶酶凍干粉的方法

　　蚯蚓凍干機(jī)在藥材凍干機(jī)制備蚯蚓纖溶酶凍干粉的方法！真空冷凍干燥技術(shù)簡稱凍干技術(shù)，是一項(xiàng)對(duì)食品護(hù)色、保鮮、保質(zhì)的高新加工技術(shù)。目前廣泛用于果蔬、肉禽、水產(chǎn)、調(diào)味品、方便食品及名優(yōu)特產(chǎn)等干燥，可達(dá)到保持食品原有的色、香、味、形、新鮮度不變的目的，且復(fù)水性特好，成品便于貯存和運(yùn)輸，費(fèi)用降低，保存期延長。在干燥蜂皇漿、人參、龜、鱉、蚯蚓等營養(yǎng)保健品，采用真空冷凍干燥工藝，更使人們相信該營養(yǎng)品純真自然。
 

　　真空凍干機(jī)制備蚯蚓纖溶酶凍干粉的方法，其特征在于，包括如下步驟：
 

　　步驟一、蚯蚓粗粉的制備：將活蚯蚓，饑餓一天，自然吐凈泥沙，洗滌，而后在溫度介于2035℃的通風(fēng)條件干燥并制成粉碎，通過100200目篩制成蚯蚓粗粉；
 

　　步驟二、粗酶溶液的制備：取蚯蚓粗粉用2倍體積的0.1mol/L，pH為7.8的磷酸緩沖液PBS勻漿，加0.1mol/LNaCl溶液，置于4℃冰箱內(nèi)過夜，然后以10000r/min，4℃離心15min，棄沉淀，取上清；上清液于50℃水浴保溫40min，流水冷卻，再8000r/min，4℃離心10min，取上清，在上清液中加硫酸銨達(dá)30%飽和度，靜置3小時(shí)，再8000r/min，4℃離心10min；收集上清液再加硫酸銨達(dá)70%飽和度，靜置3小時(shí)，再8000r/min，4℃離心10min，收集沉淀；將沉淀溶于上述緩沖液中，對(duì)上述緩沖液以載留5KD分子量的透析袋透析過夜去鹽，再將透析液8000r/min，4℃離心10min，取上清液即為蚯蚓纖溶酶粗酶溶液；
 

　　步驟三、粗酶的純化：將蚯蚓纖溶酶粗酶溶液過Sephadex G75凝膠層析，上柱前預(yù)先用0.02mol/L，pH為7.8的磷酸緩沖液平衡，上柱后用上述緩沖液洗脫至在280nm波長無光吸收，洗脫液出現(xiàn)2個(gè)蛋白峰，其中酶活性峰與第1個(gè)蛋白峰重疊，收集重疊部分的酶液，過DEAECellulose A52離子交換柱，過柱前先用0.05mol/L，pH為7.8的PBS平衡；然后用含00.5mol/L NaCl的PBS離子強(qiáng)度線性梯度洗脫，洗脫液出現(xiàn)3個(gè)蛋白峰，酶活性峰與蛋白峰第3峰重疊，其余2個(gè)蛋白峰基本無酶活性，收集活性部分即為蚯蚓纖溶酶純酶；
 

　　步驟四、蚯蚓纖溶酶的修飾：加入蚯蚓纖溶酶純酶和活化的PEG到15mL，pH9.2，0.1mol/L的硼酸緩沖液中，純酶與PEG的重量比是1:50，在30℃下，保溫反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)物對(duì)0.1mol/L，pH7.3的磷酸緩沖液透析過夜，透析液再以10000r/min，4℃離心l0min， 取上清液過柱Sephadex G75，收集活性成分，即為蚯蚓纖溶酶修飾酶；
 

　　步驟五、蚯蚓纖溶酶凍干粉的制備：將蚯蚓纖溶酶修飾酶裝在樣品盤里，料厚不超過8mm，放進(jìn)真空冷凍干燥機(jī)設(shè)備干燥室內(nèi)進(jìn)行凍干，于-35℃冷凍12小時(shí)，然后在5pa的真空度下，升溫至30℃，干燥12小時(shí)；繼續(xù)升溫至40℃，真空干燥14小時(shí)，得到蚯蚓纖溶酶修飾酶的凍干粉，其含水量為7.0%，蛋白含量為68%，酶活力為1700U/mg。